【引言】

　　志贺菌是一种主要的全球病原体，也是志贺菌病的病原体，志贺菌症是一种腹泻病，主要影响中低收入国家。志贺菌病的特点是一种复杂的、多步骤的发病机制，在此过程中，细菌利用多种入侵蛋白来操纵和入侵肠上皮。抗体，特别是针对O抗原和一些侵袭蛋白的抗体发挥保护作用，因为针对特定抗原的滴度与疾病严重程度呈反比;然而，抗体在发病过程中的作用仍有待阐明，尤其是志贺菌主要是一种细胞内病原体。在缺乏相关保护的情况下，重建志贺菌发病机制的功能测定可以提高我们对保护性抗体在阻断感染和疾病中的作用的理解。体外检测是建立保护相关性的重要工具。直到最近才建立了概括人类发病机制的动物模型，但往往不是完整的。这篇综述的目的是讨论在多步骤和多阶段志贺菌感染过程中评估多克隆血清中抗志贺菌抗体功能的体外试验。单独测量抗体水平可能会限制对疫苗全部潜力的评估。血清杀菌测定法(SBA)和其他功能测定法，如视单吞噬细胞杀伤测定法(OPKA)和粘附/侵袭抑制测定法(AIA)，在生理上是相关的，并且可以提供关于这些效应机制在保护性免疫中所起作用的重要信息。最终，该综述旨在为该领域的科学家提供关于所选择的功能测定的重要性的新观点，该功能测定可能更能代表免疫介导的保护机制。

【介绍】

　　志贺菌病是一种由结肠上皮细菌感染引起的腹泻病，其发病率和死亡率极高，全球每年死亡人数超过20万人，尤其是在非洲和亚洲。5岁以下的儿童，特别是没有母乳喂养和营养不良的儿童，以及70岁以上的成年人，患严重疾病和死亡的风险更高。志贺菌属据报道对人类具有高度入侵性，人类是志贺菌唯一的天然宿主;事实上，摄入几十个细菌就足以引起疾病。传播通常通过接触受感染的粪便、人与人之间的接触、摄入受污染的食物和水以及接触受污染的污染物通过粪口途径发生。在过去的几十年里，性接触已成为高收入国家几次疫情暴发的重要感染传播途径。典型的治疗方法是使用一线和二线抗生素周期，抗微生物耐药性急剧上升。

　　志贺菌病的病原体是四种革兰氏阴性志贺菌，即福氏志贺菌、宋尼志贺杆菌、痢疾杆菌和博伊氏志贺杆菌，通常根据O抗原(OAg)的结构(LPS的多糖部分)分为血清型。志贺菌与大肠杆菌具有广泛的基因组相关性。在进化过程中，志贺氏菌通过额外的入侵质粒获得必要的毒力基因，编码增强其入侵能力的因子。其中，三型分泌系统(T3SS)的结构成分、调节因子和效应物对宿主感染至关重要，产生介导细胞进入的针状结构。

　　现有的血清流行病学研究表明，福氏志贺菌和宋尼志贺菌是最流行的物种，根据最新的可用数据，仅福氏志贺菌五种血清型(2a、6、3a、2b和1b)就造成了中低收入国家一半以上的感染。这些病例加上宋尼氏痢疾杆菌可能占全球志贺菌病例的绝大多数。无论如何，目前的数字可能被低估了，迫切需要进行研究，尤其是按地区区分志贺菌病的重要全球负担，加上抗生素耐药性志贺菌的出现，促使迫切需要制定新的预防和治疗措施。世界卫生组织免疫、疫苗和生物制品部门已将志贺菌疫苗的发现列为优先事项，其理由是接种疫苗可降低志贺菌病的发病率和死亡率，以及使用抗生素诱导抗微生物耐药性(AMR)。尽管付出了长期的努力，但目前还没有获得许可的志贺菌病疫苗，候选疫苗仅对单一血清型具有部分保护作用

【志贺菌病的发病机制】

　　志贺菌感染结肠上皮，导致粘膜溃疡，并通过募集炎症细胞引起急性炎症。志贺菌病的分子发病机制是一个复杂的多步骤过程，至今尚未完全阐明。志贺菌对胃肠道的极端条件具有很强的耐受性，并整合了一系列环境线索，如胆汁，以提高其存活率并启动其侵袭表型。为了完成其感染周期并在环境中传播，志贺菌需要进入结肠水平的细胞内隔室。志贺菌的主要进入途径是在微折叠细胞(M细胞)中确定的，微折叠细胞是一种专门的细胞，其组成性地将物质从肠腔转移到基底外侧，由下面的有组织的肠道相关淋巴组织进行采样。到达上皮下隔室的志贺菌逃脱巨噬细胞吞噬作用，并与上皮的基底外侧表面相互作用，触发其再摄取。志贺菌直接入侵肠上皮细胞的想法传统上被忽视，因为志贺菌在体外和体内模型中感染上皮的效率都不高。然而，最近一项使用肠芯片模型的研究表明，低细菌剂量可以显著感染顶端的上皮细胞，该模型模拟了人体肠道中发现的剪切应力和蠕动的机械力。这些发现挑战了M细胞是志贺菌唯一进入点的观点，并表明目前的上皮模型可能过于简单化，不具有代表性。

　　据报道，志贺菌的粘附受环境条件的调节，如胆汁盐的存在，在研究过程中需要在体外模型中复制胆汁盐。此外，已经描述了经典的和新的粘附素的作用，如IcsA、MaM和T3SS分泌的OspE1/OspE2蛋白，但它们粘附的调节是T3SS依赖性的，并且它们的缺失并不能完全消除对细胞的粘附。有人提出，志贺菌可以通过结合肠粘膜中存在的宿主分子来介导与上皮的连接，如宿主防御肽人肠道α-防御素(HED5)，从而增强其粘附性。有趣的是，这一假设可以部分解释志贺菌人类宿主的特异性。志贺菌附着在结肠上皮上所需的粘附素可能是疫苗开发的理想靶点，但到目前为止，这些靶点还没有作为疫苗在临床上进行过测试。

　　进入细胞后，志贺菌逃离内体并扩散到邻近的上皮细胞，最大限度地减少暴露于细胞外环境和免疫细胞。在胞浆期，志贺菌通过外膜蛋白IcsA(或VirG)介导的基于动作的运动机制复制并传播到邻近的上皮细胞。简言之，志贺菌控制宿主的细胞骨架，在一个极点聚合肌动蛋白丝来推动自己。对细胞膜的推动形成了向外的伪足，其中包含延伸到邻近细胞的细菌。受体细胞最终吞噬双膜隔室，并在胞质溶胶中释放细菌。

　　LPS介导免疫逃避，因为它保护细菌免受细胞外和细胞内因素的影响，如胃环境的极端酸性，并通过减少调理作用来保护细菌免受补体介导的杀伤和吞噬作用。通过改变LPS的长度和结构，志贺菌调节对表面蛋白的可及性，从而调节免疫传感。LPS作为细菌发病机制调节剂的作用在S.sonney中得到了进一步扩展，它产生了一种结构类似于LPS OAg的多糖胶囊。发现该荚膜的存在通过掩盖入侵的相关关键毒力蛋白，例如IpaB，大大降低了宋内志贺菌入侵HeLa细胞的能力。另一方面，荚膜增加了对补体介导的杀伤的抵抗力和在兔子模型中传播的能力。LPS在入侵过程中是否具有特定作用尚不完全清楚。体外模型研究表明，LPS可能不是细胞进入所必需的，因为宋奈氏菌和福氏菌的ΔOAg菌株通常用于入侵HeLa和其他细胞类型。对极化上皮的研究表明，LPS可以通过基底外侧膜增强粘附和侵袭。这与缺乏OAg的突变体的毒性低于野生型突变体的观察结果一致，如角结膜炎的豚鼠模型所示。总的来说，对志贺菌的自然获得保护是血清型特异性的，这一事实证明了LPS作为志贺菌适应因素的基本作用。

　　流行病学研究支持使用基于抗体的志贺菌生物制剂，表明生活在志贺菌流行国家的成人和儿童的自然免疫力可以预防疾病或降低严重程度。胎盘转移的IgG在婴儿出生的头几个月保护婴儿免受感染。母乳中针对毒力质粒相关抗原的高水平志贺菌特异性分泌型IgA(sIgA)可提供部分保护，甚至可预测志贺菌感染婴儿的症状状态。在兔回肠环感染模型中研究了其拟议的作用机制，并将其归因于抗体减少结肠上皮侵袭(免疫排斥)的能力和对有害炎症反应的下调。

　　LPS是志贺菌最丰富的表面抗原，在流行病学和临床研究中已被确定为潜在的保护性抗原。已有证据表明，针对志贺菌LPS的血清IgG抗体可能是保护作用的机制免疫相关性。最近，对以色列1-4岁成人和儿童宋内志贺菌糖缀合物两项试验的血清学和疫苗效力数据的重新分析证实了抗宋内志贺菌之间的相关性。具有疫苗效力的宋内志贺菌LPS抗体。

　　候选亚单位疫苗中基于向免疫系统显示OAg的不同技术，从经典的缀合物到与载体蛋白TT缀合的合成碳水化合物，与铜绿假单胞菌(rEPA)的重组外毒素A生物偶联，与从转基因志贺菌纯化的外膜囊泡代表的递送系统生物偶联。不幸的是，由于志贺菌OAg的高变性，需要来自不同血清型的OAg的组合来诱导对志贺菌病的广泛保护，尽管福氏菌OAg之间存在一定水平的交叉反应性，这可能导致交叉保护。针对志贺菌蛋白的抗体，包括毒力因子如Ipa，也存在于感染受试者的血清中。与高变LPS相比，蛋白质抗原在志贺菌属中表现出更保守的优势。在婴儿和自然感染者的脐带血中发现了高抗T3SS蛋白滴度，表明其具有保护作用。已经尝试了靶向志贺菌蛋白的疫苗方法，例如针对外膜蛋白酶IcsP，然而在目前临床开发的疫苗中，蛋白质抗原与LPS结合。

【志贺氏菌血清学检测】

　　血清学通常测定来量化抗原特异性抗体水平及其功能，来分离针对志贺菌的系统体液反应。除了抗体的定量，功能测定是血清学方法，能够在体外测量抗体中和或抑制志贺氏菌致病性的关键效应功能的能力。粘膜体液反应的分离不在本综述的范围内，尽管如此，下面描述的一些血清学测定可以应用于胃肠道分泌物，如粪便或直肠拭子，以提供有关粘膜抗体的信息。

　　最广泛使用的测定抗体与单一抗原结合的特异性并量化其在血清或其他样品中的丰度的测定法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)。简言之，将抗原包被的板与感兴趣的血清孵育，并且通过与酶缀合的针对第一抗体的宿主物种的第二抗体的结合来揭示抗体结合，以用感兴趣的底物扩增信号。ELISA非常简单，可以自动化以提高产量和操作员独立性，并且可以很容易地转移到不同的实验室，包括那些技术水平较低的实验室。流式细胞术通常用于评估血清与整个志贺菌的结合，而不是单个抗原。

　　多重技术提供了同时询问多达数十种抗原的额外选择，使操作员能够并行研究血清对几种抗原的数量、特异性和交叉反应性。就产量而言，ELISA和Luminex测定可以以384孔板的形式开发，从而在进行测定所需的样品量较低的情况下获得高通量。考虑到志贺菌OAg类型的数量很高，多重免疫测定提供了最方便和节省样本的方法来筛查自然感染和接种疫苗的个体中的多种OAg。已经发表了含有IpaB、IpaC、IpaD和来自宋尼链球菌、福氏链球菌和痢疾杆菌的纯化LPS的6倍组，其中Luminex滴度被证实与ELISA相关。

　　与天然抗原相比，抗原表达/提取、纯化和用于包被或偶联目的的修饰不可避免地会带来变化。在志贺菌病发病机制中重要的不同关键抗原中，选择细菌用热苯酚提取纯化的LPS作为免疫测定中的一致包被抗原，以测定针对不同血清型志贺菌的抗体滴度额外的分析可以更好地确定抗体的类/亚类特征和亲和力。在抗体是复杂分子的情况下，功能性来自Fab相关属性以及Fc介导的效应器功能的贡献。因此，功能测定应与旨在表征和剖析免疫反应的上述相关属性的测定相结合。抗体亚类尤其可以至少部分预测抗体功能，因为效应器功能在免疫复合抗体的尾部区域水平上受到蛋白质差异和糖基化的调节。该领域的专家一致认为，体液反应值得通过使用功能测定法进行更深入的表征，通常是血清杀菌测定法(SBA)或视单吞噬细胞杀伤测定法(OPKA)。

【志贺氏菌病的功能测定】

　　为了在临床前水平上评估主动和/或被动免疫后疫苗制剂诱导的保护作用，经常使用动物的激发模型。由于志贺菌是一种人类限制性病原体，目前为评估候选疫苗的潜在保护效力而开发的动物感染模型并不能很好地反映人类感染。所提出的小动物挑战包括豚鼠模型(直肠内途径)、豚鼠、兔子或小鼠的角结膜炎(Sereni试验)、兔结扎回肠环模型、小鼠肺模型(鼻内途径)，和小鼠腹膜模型。R.Guerrant小组开发了一种小鼠腹泻模型，该模型允许口服细菌，但每只小鼠接种108个细菌。最后，Mitchell及其同事在NAIP–NLRC4炎症小体缺陷小鼠中开发了一种对志贺菌病敏感的口服感染小鼠模型，然而，只有在通过链霉素治疗清除微生物菌群之前才可能感染，这可能会改变入侵过程的第一步。最终，通过控制人类感染模型(CHIM)在人体中测试候选志贺菌疫苗似乎是评估其疗效的最有价值的方法。然而，在LMIC中，CHIM通常在天真的成年受试者身上进行，而不是在婴儿身上，因此他们的免疫反应可能不能代表目标人群。在确定保护性免疫反应后，不仅从质量上，而且必须从功能上对其进行分析，以确定保护的替代物。这种评估必须依赖于功能测定。

　　评估抗体功能的体外测定是更好地表征引发的体液反应特征的关键，有助于疫苗的开发。与评估抗体量或简单地与细菌结合(如流式细胞术)的方法相反，功能测定模拟宿主免疫反应对抗感染机制的能力。事实上，抗体的不同效应器功能可能在宿主的特定小生境或感染生命周期的某些步骤中发挥作用，病原体可以调节抗原的表达，以此作为感染机制，进而逃避宿主反应。

　　功能测定也可以旨在测量抗体介导的免疫效应器功能，例如吞噬细胞介导的细菌杀伤或补体介导的裂解。Bernshtein等人对志贺菌CHIMs或临床试验中这些功能测定结果与有利临床结果之间的相关性进行了广泛审查。在这里，我们概述了志贺菌疫苗开发中使用的功能测定。为了便于阅读，在图1中，我们报告了下面描述的每一组主要功能测定的简化方案：血清杀菌测定(SBA)、视蛋白吞噬细胞杀伤测定(OPKA)和粘附/侵袭抑制测定(AIA)。在图2中，我们表示了每个功能测定的生理相关性。

　　图1分析志贺氏菌抗体反应的三种主要功能分析方法：SBA、OPKA、AIA

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　　图2 主要的功能分析，以评估体液反应对抗志贺氏菌病的发病步骤

【血清杀菌试验】

　　血清杀菌试验(SBA)通过测量补体介导的革兰氏阴性菌(如志贺菌)的裂解来评估调理抗体的功能。结合细菌表面的相关亚类抗体激发补体激活的经典和替代途径，沉积补体元素，最终形成裂解孔(BOX1)。SBA是疫苗开发人员用于测量抗革兰氏阴性菌抗体功能的最广泛的功能测定法。事实上，SBA通常用于分析针对志贺菌的体液反应。无论是来自自然暴露的个体、挑战患者还是接种疫苗的患者。在几项研究中，高SBA滴度与对中度至重度疾病的一定程度的保护有关，这表明SBA可能是保护的功能相关性，概括了抗体在志贺菌发病机制中的积极作用。杀菌活性主要归因于抗LPS/OAg抗体，可能是因为LPS提供了丰富和重复的表面抗原，有利于抗体的六聚化，从而有利于补体沉积。

　　杀菌活性本身在志贺菌病发病机制中的作用仍有待阐明，因为感染通常局限于结肠粘膜，肠外并发症很少。细菌裂解只能发生在细胞外基质相对富含补体和血清抗体的上皮下方。因此，SBA滴度可以提供一个有用的指示，说明保护性抗体如何增强志贺菌补体的敏感性和防止基底外侧再次感染的能力。肠腔也可能是补体介导的裂解的忽略设置，因为在肠表面发现了IgM和IgG以及至少一部分补体元素。SBA滴度如何在这方面反映粘膜免疫是一个有待研究的问题。

　　检测方案认为，细菌与调理抗体源以及外源性补体源一起孵育，最常见的是幼兔补体(BRC)(图1)。待测抗体激活补体，导致细菌裂解。测定的结果通常表示为50%的抑制浓度(IC50)，其指示与阴性对照相比杀死一半总细菌所需的抗体或血清的浓度。已经实现了对经典测定的几项改进，主要旨在缩短测定的持续时间并提高其产量，包括将测定小型化为384孔形式，以及与平板和计数存活菌落形成单位(CFU)相比，可简化读数。基于比色、发光和/或荧光读数的替代方法已将SBA转换为一天测定。这些读数通常来源于活细菌与代谢试剂的反应。Necchi等人开发了一种基于发光的SBA(L-SBA)方案，该方案可检测活细菌产生的ATP，并且该方法已得到优化和表征，以分析来自多项研究的临床样本。Resazurin提供了一种替代的比色和荧光终点。该测定的局限性包括需要根据其固有的补体敏感性，即通过自发补体激活裂解多少细菌，对所使用的每种志贺菌菌株调整测定条件。

【吞噬细胞和杀伤试验（OPA/OPK）】

　　调理吞噬细胞测定法(OPA)和调理吞噬细胞杀伤测定法(OPKA)测量抗体介导吞噬细胞内化和/或杀伤志贺菌的能力。志贺菌的吞噬试验不仅提供了一种测量抗体与效应免疫细胞结合能力的方法，而且可以为该疾病的发病机制提供线索。在感染过程中，志贺菌与位于派尔贴片下的上皮下巨噬细胞和募集的多形核细胞(PMN)相互作用。这两种细胞类型都通过吞噬受体——Fcγ受体(FcγR)和补体受体(CR1和CR3)——感知调理细菌，并最终吞噬和清除病原体。然而，吞噬作用可能是一把双刃剑，因为吞噬细胞放大的过度炎症可能会对宿主产生负面影响。事实上，志贺氏菌通过释放破坏组织的促炎细胞因子操纵诱导上皮下巨噬细胞焦下垂的炎症反应，并通过释放有毒颗粒物使PMN坏死，从而破坏上皮屏障。此外，有人提出，被招募到固有层感染部位的PMN可以通过上皮层迁移，提供额外的进入途径以及破坏性的炎症环境。PMNs募集的抑制，以及体内相关促炎细胞因子的抑制，保持了上皮的完整性。志贺菌病发病机制的这些方面鼓励建立和使用吞噬作用测定法，以不仅验证志贺菌的摄取，而且验证其迅速有效的清除，以及抗体的存在是否可以调节有利于清除的结果并包含附带损伤。

　　在吞噬作用测定方案中，将吞噬细胞与调理志贺菌孵育适当时间。然后通过多种可能的读数评估细菌(或细菌的替代物)的内化和/或杀死，包括菌落的CFU计数，或基于流式细胞术(图1)。根据细胞类型和所用调理素的组合，该测定提供了不同的适应症。像THP-1单核细胞这样的非分化细胞不能杀死，并且只能提供抗体介导的靶标内化的指示。相反，通过使用更特化的细胞(例如，原代中性粒细胞、分化的HL-60、分化的THP-1巨噬细胞)，可以评估血清的杀伤效率。补体通常被添加到测定中，以评估FcγRs-和CR介导的协同摄取和杀伤。

　　OPKA已经被用于评估临床样本的功能。首先建立了具有分化HL-60的经典OPKA，以评估在BRC存在的情况下用接种疫苗和激发患者的血清调理的志贺菌的杀伤作用，从而最终将功能性抗体活性和保护作用联系起来。与相应婴儿的脐带血相比，同样的测定方法用于测量保护性母体血液诱导的功能反应。OPA和OPKA都被插入功能测定的系统血清学小组中，不同之处在于OPKA是用原代人中性粒细胞而不是分化的HL-60进行的。使用来自全血的THP-1单核细胞和中性粒细胞的基于流式细胞术的OPA来评估涂有感兴趣的抗原而不是整个志贺菌的珠的调理吞噬作用.有趣的是，虽然SBA和OPKA的结果通常相互关联，并且就症状严重程度而言，用特异性抗原进行的OPA测定提供了新的见解，与SBA和OPKA滴度相反，OAg和IpaB抗体与症状严重程度呈负相关。最后，使用经典的OPKA来评估用候选的基于GMMA的疫苗免疫的小鼠的免疫反应。

　　OPA和OPKA存在一些困难，其中包括补体和细胞条件的调节，必须对其进行精细调整，以欣赏吞噬细胞衍生的杀伤，而不是血清杀菌测定。此外，当使用流式细胞术或荧光显微镜来获得实验条件以获得每种细菌菌株的足够荧光时，必须优化。

【粘附/侵袭抑制试验】

　　入侵测定已被广泛用于鉴定介导宿主-病原体相互作用的靶标，并主要通过T3SS确定宿主细胞的入侵。IpaB被描述为与脂筏中的HeLa表面受体CD44和胆固醇相互作用，而IpaB-CD复合物与整合素α5β1结合，将细菌锚定在细胞表面，并促进T3SS在其上形成孔。

　　粘附/侵袭抑制试验(AIA)用于证明抗体，特别是针对Ipa蛋白的抗体，降低毒力的能力。概括分析方案，通常以96孔板形式组织的复杂度可变的体外细胞模型感染一定数量的活细菌，这些活细菌在含有感兴趣抗体的溶液中调理(图1)。培养时间根据所需读数进行调整：几分钟可以更好地评估粘附性，几小时可以更好地了解入侵。通常情况下，通过重复的洗涤步骤将多余的细菌从细胞中冲洗掉。最后，细菌的粘附/侵袭率可以通过两种主要方法相对于非调理对照进行评估：总细菌或内部细菌的CFU计数(在庆大霉素处理细胞以杀死外部细菌时)，或者通过免疫荧光显微镜，可能用复染物来区分内部细菌和外部细菌。

　　动物血清和抗IpaD、IpaB和IpaC的单克隆抗体被证明可以降低毒力细菌在体外细胞模型中感染的能力。这些工作与动物模型中的研究一致，在动物模型中，用IpaB和IpaD免疫的小鼠在攻击时产生保护性免疫反应(IgG和IgA)，因此在体内证明了抗Ipa抗体的相关性。然而，Ipa蛋白的中和可能会受到一些因素的损害，如影响从胞质溶胶转移到细菌表面的环境线索、Ipa在尖端复合物中对抗体结合的短暂可及性。

　　此外，入侵检测被用于评估OAg的重要性，不仅在SBA的情况下，而且在感染期间。事实上，Chowers及其同事表明，用LPS的福氏志贺菌2a或宋尼志贺菌OAg部分免疫的儿童血清抑制同源菌株对上皮细胞Caco-2的侵袭。Caboni等人还证明，宋尼S.sonney的OAg同源胶囊的存在削弱了HeLa细胞的侵袭。

　　分化上皮的更复杂模型包括Caco-2和RajiB细胞的共培养，以产生具有跨细胞M细胞的成熟肠毛囊相关上皮。该模型用于提出M细胞到肠细胞的途径是志贺菌的主要传播途径，以避开基底外侧隔室。使用来自原发组织的2D人类肠道类肠(HIE)作为感染模型，证实了来自M细胞和基底外侧隔室的优先感染。HIE可以与PMN共同培养，以研究志贺菌与PMN上皮细胞相互作用的相互作用。最后，来源于原代人类组织的3D上皮类器官可能是志贺菌感染的一个有趣的模型，特别是具有相反极性的顶端外类器官将代表另一个有用的模型，用于研究上皮顶端与基底外侧的侵袭。

　　如前所述，志贺菌传统上被观察到从顶端表面侵入极化体外细胞模型的能力很低，以至于在许多实验模型中，细菌必须通过离心作用被强迫进入细胞，使用表达异源蛋白以人工增强粘附的志贺菌突变体、AfaI粘附素，即使在存在M细胞的情况下也是如此。志贺菌在这些培养物中的粘附/侵袭机制是否忠实于感染的生理学是一个有争议的问题。

　　免疫球蛋白在肠腔中的状态仍然是确定功能性/非功能性单克隆抗体比率的基本主题。一个例子是，mAb不仅作为单个实体存在于肠腔道中，而且与分泌成分(SC)复合。SC是聚合物Ig受体的可溶性部分，负责IgG从肠道的基底外侧转移到管腔空间。当IgG聚合物Ig受体复合物暴露在管腔中时，存在于消化道中的蛋白酶将该受体的跨膜成分从SC上裂解，SC保持附着在IgG上。SC-IgG复合物有利于IgG在肠腔道中的半衰期和IgG自身的效应器功能。事实上，研究表明，只有在SC存在的情况下，针对福氏志贺菌的LPS特异性单克隆抗体才能对上皮细胞发挥保护作用。

【接触溶血试验】

　　T3SS介导的膜裂解，可能通过易位诱导的孔形成，需要与真核细胞表面接触。利用这一特性，Sansonetti及其同事建立了一种接触性溶血测定法，将志贺菌与绵羊红细胞孵育，导致血红蛋白在溶液中释放，从而为膜裂解提供比色读数。溶血被证明是T3SS依赖性的，并且是1)温度依赖性，因为已知T3SS的表达发生在37°C而不是30°C;2) 质粒编码，当检测非侵入性志贺菌时没有发生;3) 接触介导的细菌和红细胞之间的粘附必须通过细菌在红细胞上的造粒来诱导。

　　有趣的是，Clerc等人证明志贺菌的接触性溶血量与穿透HeLa细胞的能力相关，这表明接触性溶血测定可能代表吞噬液泡裂解的初始步骤的时间和成本效益近似值，这是细菌在结肠上皮细胞内增殖的关键步骤。

　　自1986年以来，接触溶血试验在随后的工作中再次使用，以证明毒力因子的膜破坏活性，并研究T3SS转运子IpaBD。到目前为止，只有Sieroki等人使用接触性溶血作为功能测定来证明交叉反应性抗IpaD(志贺氏菌)-SipD(沙门氏菌)单克隆抗体抑制膜裂解的能力。有趣的是，测试的抗体(mAb-IpaD-318)被发现可以增强红细胞的溶血，但不能增强HeLa细胞的侵袭。作者假设mAb-IpaD-318将聚合的IpaD稳定在中间构象，该构象失去了控制正确的IpaB和IpaC易位的能力。据报道，针对IpaD的抗体片段也可显著减少野生型福氏菌的红细胞溶血。

【系统血清学方法】

　　迄今为止，研究的单一抗体特异性、质量或效应功能似乎都不是志贺菌病保护性免疫的绝对预测因素;因此，额外的抗体功能和/或不同方面的整合有可能预测针对志贺菌的成功体液免疫。Galit Alter团队于2015年首次开发的系统血清学方法，通过一系列不同的血清学检测询问临床血清样本，然后通过机器学习和其他高维工具整合结果，以定义与各种疾病的良好患者结果相关的特异性抗体谱，包括志贺菌病。该图谱通过功能测定和生物物理测量来询问Fc效应器的功能。

　　Bernshtein及其同事应用系统血清学方法在CHIM中对福氏2a链球菌攻击患者的血清进行了分析。在他们的研究中，他们采用了以下高通量定量抗体测定法：通过Luminex，他们确定了与感兴趣的抗原(多种LPS类型，IpaD、IpaB、IpaC、IpaH、VirG)结合的抗体的亚类或同种型(IgG1-2-3、IgA1-2、IgM)。有趣的是，Fcγ受体与免疫复合抗原的结合被强烈推荐为抗体效应器功能的可能预测因子，这一方面在血清学实验室中没有常规使用。

　　对调理珠和活志贺菌进行功能测定(补体沉积、SBA和OPA/OPK)。为了测量补体沉积，将免疫复合物与幼兔补体孵育，以确定抗体启动补体级联的能力。据我们所知，这种检测方法也没有常规使用，尤其是在蛋白质靶点上，因为活志贺菌上的补体沉积主要由抗LPS抗体驱动。然而，这种测定可能有助于概括具有蛋白质特异性的抗体的有用功能方面，例如揭示一些蛋白质靶标在更多地暴露于细菌表面时仍然可能是补体沉积的驱动因素。珠上的补体沉积与活志贺菌上的经典SBA相结合。

　　至少有三种主要和互补的功能测定被描述为吞噬作用：全血中的抗体依赖性中性粒细胞吞噬作用(ADNP)、抗体依赖性细胞(单核细胞)吞噬作用(ADC)，两者都用免疫复合珠进行，以及用活志贺菌进行的经典OPK

【结论】

　　针对人类病原体的疫苗是改善全球健康和对抗新出现的抗微生物耐药性的基本工具。评估抗体生物物理特性和抗体功能的体外试验是识别保护性体液反应特征的关键，极大地帮助了疫苗的开发。在缺乏与保护相关的抗体类别或亚类(例如IgA与IgG)的明确指示，以及与不同年龄组的临床保护相关的关键和验证水平的情况下，证明抗体中和病原体活性并更好地杀死病原体活性的能力是关键。然而，功能测定是病原体特异性的，仅概括了宿主-病原体相互作用的精确步骤。从技术角度来看，功能测定需要提供足够的产量，以允许以成本效益高的方式筛选多个样品。因此，理想的功能测定平衡了生理相关性、合适的产量和成本效益。

　　在这篇综述中，我们介绍了用于评估抗志贺菌抗体功能的主要功能测定法，并讨论了每种测定法可以近似于志贺菌感染机制的不同阶段(图2)。SBA滴度已被证明与有效的抗体诱导的补体介导的杀伤相关的保护增加相关。然而，我们可以推测，SBA的价态可以延伸到细菌裂解之外，间接提供了调理对活细菌功效的一般指示，而调理是多种免疫防御机制的核心。众所周知，SBA滴度与OPA/OPK滴度有关，因为这两种机制依赖于抗体依赖性补体沉积，其可以通过Fcγ受体和吞噬补体受体CR1和CR3向吞噬细胞发信号。补体在细菌上的沉积也产生了一个重要的细胞内防御信号，有利于细胞内病原体的自噬和清除，SBA滴度也可以反映这一点。

　　志贺菌在结肠上皮中的渗透可以说是志贺菌病发病机制中被抗体抑制的最关键的步骤。因此，测量抗体防止体外上皮模型粘附和/或侵袭的能力的功能测定是基本工具。重要的是，粘附/侵袭测定是唯一模拟发生在肠腔水平的事件的测定，为测试抗体的粘膜亚类的重要性开辟了有趣的选择。尽管有明显的重要性，但到目前为止，临床测试中还没有进行粘附/侵袭分析。

　　在建立这种功能测定的困难中，有一个是确定要测试的抗体的相关靶点。事实上，抗体的效应器功能可能在宿主的特定生态位或感染生命周期的某些步骤中发挥作用，而病原体可以调节抗原的表达，作为感染机制，进而逃避宿主反应。虽然SBA主要由靶向LPS的抗体驱动，但入侵的最初步骤(尚未完全阐明)是由T3SS介导的，可能与其他毒力因子结合，大大增加了待处理的可能靶点的复杂性，或者表明在感染过程的各个步骤期间多种抗体和机制的协同作用。

　　相关表面抗原的表达和结构修饰可能受到环境因素的调节，如胆盐暴露、pH、温度、葡萄糖浓度和氧气，这些因素被认为是细菌在小肠和大肠之间定位的信号。在标准化细菌生长/条件以进行实验时，必须考虑这些因素，脱氧胆酸盐和氧密度与真核细胞膜的存在相结合可能是最有前景的。

　　总之，一组多功能检测的可用性将是在临床前和临床环境中分离志贺菌感染或疫苗接种诱导的免疫反应的基础，并揭示抗体在诱导对志贺菌病的保护中所起的作用。
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　　原文出处：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10227456/

　　指导老师：王战辉