非瘟抗体ELISA检测知识点梳理
发布时间：2021-07-07 15:40:49来源：原博士带你做检测
备受期待的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒名单终于公布了，我为大家准备了一些非瘟抗体ELISA知识点，能让大家在被口吐莲花的销售代表忽悠时保持一颗平常心。
33个非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中有3种类型的ELISA，分别是间接ELISA(17个)，阻断ELISA(12个)和夹心ELISA(4个)。依据的是国标《非洲猪瘟诊断技术》(GB/T18648-2020)中的三种ELISA抗体检测方法。
1.间接ELISA
IgG抗体，
间接ELISA通常用于测定血清中理论上也可以检测IgM抗体，但是IgM抗体通常使用捕获ELISA来检测。间接ELISA是应用最广泛的ELISA方法，由于只要获得抗原，配合通用的酶标抗猪IgG的二抗就可以快速建立ELISA方法。产品性能取决于抗原的纯度，抗原纯度不够会导致非特异IgG的结合，产生假阳性。
实验流程通常为：
1)准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
加样：
2)加待检测的样品。温育反应一定时间，如果血清中含有针对包被抗原的抗体，则待检抗体与固相抗原发生特异性结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。
加酶标二抗：
3)加入酶标抗抗体(二抗)，该酶标二抗与抗原抗体复合物结合形成抗原—待测抗体—酶标二抗的复合物，温育，洗涤。
显色：
4)加入底物溶液，温育一定时间后，固相上酶的催化底物产生有色产物，
终止：
5)加入终止液终止显色反应。
读数：
6)使用酶标仪测定各孔光密度值(OD值)。
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2.阻断ELISA/竞争ELISA
IgG抗体
阻断ELISA/竞争ELISA通常用于测定血清中。阻断ELISA/竞争ELISA需要抗原和特异性的单抗或多抗。对抗原的纯度要求不高，产品的性能取决于单抗或多抗的特异性和亲和力。背景干扰低，特异性高。
实验流程通常为：
1)准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
加样：
2)加待检测的样品。温育反应一定时间，如果血清中含有针对包被抗原的抗体，则待检抗体与固相抗原发生特异性结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。
加竞争抗体：
3)加入酶标单抗或多抗，该酶标单抗或多抗与待测样品竞争性与包被抗原结合，形成抗原—酶标抗体的复合物，温育，洗涤。
显色：
4)加入底物溶液，温育一定时间后，固相上酶的催化底物产生有色产物，
终止：
5)加入终止液终止显色反应。
读数：
6)使用酶标仪测定各孔光密度值(OD值)
3.双抗原夹心ELISA
IgM、IgG、IgA等
双抗原夹心ELISA用于测定血清中。技术难度最高，需要制备高质量的酶标抗原。该方法不受非特异性IgG的干扰，背景干扰小，敏感性和特异性高。
实验流程通常为：
1)准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
加样：
2)加待检测的样品。温育反应一定时间，如果血清中含有针对包被抗原的抗体，则待检抗体与固相抗原发生特异性结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。
加酶标抗原：
3)加入酶标抗原，该酶标抗原与抗原抗体复合物结合形成抗原—待测抗体—酶标抗原的复合物，温育，洗涤。
显色：
4)加入底物溶液，温育一定时间后，固相上酶的催化底物产生有色产物，待测样品中
终止：
5)加入终止液终止显色反应。
读数：
6)使用酶标仪测定各孔光密度值(OD值)。
根据文献中报道具有诊断学意义的蛋白主要有P72(VP73)蛋白、P54蛋白、P30(P32)蛋白、PP62(P60)蛋白。
1.P72（VP73）蛋白
结构蛋白，由B646L基因编码，分子量约为73.09kDa。VP73在大多数毒株中相当稳定，能与所有感染猪的血清发生免疫学反应，且其抗原性非常稳定。该蛋白是血清学诊断方法的理想抗原，常被用于抗体检测。
2.P54蛋白
结构蛋白，由E183L基因编码，大小约25kDa。在病毒感染的早期阶段发挥作用，是病毒的复制必需蛋白。P54蛋白具有较好的免疫原性，其产生的抗体能够阻断病毒颗粒粘附到易感细胞上，该蛋白较为保守，产生的抗体在体内出现时间早，持续时间长。
3.P30（P32）蛋白
主要结构蛋白，由CP204L基因编码，在病毒感染的早期表达，可用于ASF感染早期诊断。
4.PP62（P60）蛋白
由CP530R基因编码，在病毒复制晚期表达，经过加工生成P35蛋白和P15蛋白。
用于 ASFV 抗体检测的抗原及其作用
可能会有很多人开始纠结于到底选择包被哪种蛋白的试剂盒，个人觉得对于ELISA试剂盒来说，蛋白选择固然重要，但是试剂盒的生产工艺对试剂性能的影响更大。
三、非洲猪瘟病毒抗体消长
根据ReisAL试验数据，E183L/ p54, K205R, A104R/histone-like 和 B602L抗体反应强，14天IgG抗体100%转阳，持续39天以上。B646L/p73, CP204L/p32, CP312R, NP419L/DNA ligase 和F334L抗体反应中等，14天IgG抗体未100%转阳，但可以检测到。K196R, K78R/p10 和 C44L抗体较弱。。
ASFV12种蛋白的IgG抗体
E183L/ p54, K205R, A104R/histone-like和B602L四种蛋白的IgM抗体7天可以检测到，14天开始下降。
ASFV4种蛋白的IgM抗体
四、抗体检测的确诊方法
（以某个品牌的所谓进口试剂盒去评价其他ELISA试剂盒的方法是错误的）
ELISA虽然简单易得，但是ELISA应用于筛查检测时仍然会出现假阳性和假阴性的结果。那么用什么方法去作为ELISA方法的确诊方法呢?
根据OIE陆生动物手册，可以使用间接免疫荧光(indirect fluorescent antibody，IFA)、间接免疫酶(indirect immunoperoxidase test ，IPT))和免疫印迹(immunoblotting ，IB)的方法作为ELISA实验的确诊方法。
(The most commonly used is the ELISA , which is suitable for examining serum or plasma. Confirmatory testing of ELISA-positive samples should be carried out using an alternative test, such as the IFAT, IPT or immunoblotting)
五、ELISA试剂盒的选择
市场上一下出现33个合法ELISA试剂盒究竟那个好呢，公告里也没告诉大家详细的比对数据，只能自己去选择了。
1.看研发实力
2.看试验数据
3.看临床应用
4.开展试剂盒评价
实验室应具备一定的试剂评价能力，评价方法见：诊断试剂评价系列3-血清检测方法。
六、不同使用场景下ELISA试剂盒的使用
1.鱼和熊掌不可兼得
世界上不存在敏感性和特异性都是100%的诊断试剂。ELISA试剂盒的敏感性和特异性就像一个跷跷板，每个厂家都会根据自己产品的定位找一个平衡点。或者要敏感性高一些牺牲特异性，或者要特异性高一些牺牲敏感性，或者取敏感性和特异性都不是最高，但是很均衡。
2.使用场景的选择
3.组合应用
对于发病场的筛查，需要先使用高敏感性的试剂进行初筛，阳性样品再用高特异性的试剂进行复核。
核酸检测和抗体检测也需要定期组合检测，保证猪群的双阴性。
一年来猪价起伏，养猪人实属不易。希望诊断试剂厂家能够真正为产业创造价值，为非瘟防控提供有效的工具。
参考文献：
[1]王功民，田克恭.非洲猪瘟[M].北京：中国农业出版社.2010年.
[2]田克恭，李明.动物疫病诊断技术：理论与应用[M].北京：中国农业出版社.2014年.
[3]AFRICAN SWINE FEVER: DETECTION AND DIAGNOSIS.FAO
[4]AFRICAN SWINE FEVER.3.08.01.OIE
[5]ReisAL, Parkhouse RME, Penedos AR, Martins C, Leitão A. Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infected experimentally with African swine fever virus. J Gen Virol. 2007 Sep;88(Pt 9):2426-2434.