【摘要】

大麻毒素的高灵敏检测对于现场快速筛查非法药物非常重要，大麻的主要成分为（-）Δ⁹ -四氢大麻酚（THC）。本研究制备了通过N-(3-二甲氨基丙基)-N ' -乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联捕获抗体的硝酸纤维素膜（NC膜），以检测抗体-THC免疫复合物。TEMPO氧化的纳米纤维素（TOCNF）具备高体表面积比、OH基团丰富、高亲水性等优点。在表面等离子体共振（SPR）中观察到抗体牢固结合在NC膜上且保持了生物活性，检测范围为1-10 μg/mL。使用HRP标记的检测抗体作为检测抗体，通过比色法在纸基上实现了THC的定量检测，与依靠静电作用的物理吸附连接的界面相比，共价作用连接的界面检测效率更高。虽然抗体与未修饰的NC膜能够有效结合，但超分子吸附导致的捕获抗体与免疫复合物的结合率较低，因此，本研究开发的锚定捕获抗体的NC膜具有重要意义。

1. 简介

据联合国《2021年世界毒品报告》称，大麻是全球使用最多的非法药物，约占全球毒品消费量的一半。大麻的主要精神活性成分是（-）Δ⁹ -四氢大麻酚(THC)，与中枢神经系统中的受体结合可以引起欣快感，四氢大麻酚的代谢物11-甲基-9-羧基-9-四氢大麻酚(THC- COOH)，也是常见的检测靶分子。随着即时检测需求的增加，唾液中靶标的检测也是十分必要的。为了开发高度准确、灵敏的检测方法，抗体或其他识别元件需要有效结合在检测界面上，而吸附的不良可能导致抗体丧失生物活性或与流动相中的样品分离。

NC膜通常被用作LFAs的反应膜，它能够不可逆地结合蛋白质，具有良好的信噪比。商业NC膜通常是疏水的，需要表面活性剂提供流动性，但表面活性剂的存在限制了捕获抗体的结合。碳二酰亚胺交联是使用最广泛的偶联带有羧基或胺基化合物的方法，已有报道成功通过EDC/ NHS法将人抗免疫球蛋白抗体偶联在TOCNF膜上，此外还有羧甲基纤维素(CMC)膜等。纤维素具有高生物相容性、低成本、低毒性等优点，其吸水性和亲水性促进了免疫复合物在水相中的相互作用。然而，在药物快速检测领域，基于TOCNF作为识别元件的锚定界面仍未经探索。

方案1. 基于传感元件固定在纤维素上的THC检测系统示意图。特异性抗THC的捕获抗体(anti-IC)的伯胺基通过 EDC/NHS与 TOCNF 的羧基之间形成酰胺键，形成能够结合抗 THC + THC 免疫复合物的生物界面。

方案1展示了TOCNF上的抗体通过EDC/NHS化学结合及目标免疫复合物与捕获抗体结合的示意图。SPR的核心部件包括光学系统、传感器芯片、液体处理系统三个主要部分，基于SRP比较了生物界面偶联抗体与物理界面吸附抗体的检测性能。通过比较具有高电负性TOCNF和电中性纤维素的吸附能力，考察了表面电荷对分子相互作用的影响。此外，还建立了纸基比色法LFAs，纳米纤维素吸水后的膨胀提供了亲水间隔环境，有利于保持固定的捕获抗体的功能活性，有利于结合辣根过氧化物酶(HRP)标记的捕获抗体+THC复合体，减少了样本液体流动时检测抗体被消耗的风险。

2. 结果与讨论

2.1. 捕获抗体生物界面的制备及SPR中THC的检测

首先验证了捕获抗体在TOCNF上的非特异性吸附。图1a显示了抗体吸附到TOCNF表面的SPR示意图，带负电的纳米纤维素表面对带正电的捕获抗体(等电点6.5-9.5)有显著的吸附作用，吸附质量达1370 ng/cm²。并对照捕获抗体在不带电荷的纤维素表面上的吸附，在pH值为5时，捕获抗体与TOCNF表面的主要依靠静电作用吸附，显示其吸附量高于EDC/NHS修饰的TOCNF(图1A和表1)。此外，研究了表面、THC、捕获抗体之间的非特异性相互作用，图1B显示无封闭试剂时，检测抗体在TOCNF上有较高非特异性吸附，图1C显示仅有THC存在时，与TOCNF表面没有表现出强相互作用，表1展示了非特定相互作用的吸附质量。

表 1 SPR中的捕获抗体固定和非特异性结合。

图 1. SPR 传感图：a) 在 pH 5 下，15 μg/mL 捕获抗体吸附到 TOCNF 和纤维素上，b) 15 μg/mL 捕获抗体吸附在 TOCNF 上，有（蓝色）和没有（红色）BSA 封闭， c) TOCNF 吸附 1 μg/mL THC（无封闭）。

此外，对于TOCNF表面物理吸附的抗体检测免疫复合物灵敏度的研究也十分重要。尽管TOCNF上吸附了大量的抗体(图2a和表1)，但经过BSA封闭后不能有效结合免疫复合物(表2)，并且免疫复合物在洗涤后很容易从物理吸附的表面去除，表明物理吸附的抗体以非活性构象附着，阻止了免疫复合物的正确结合。此外，与免疫复合物与TOCNF表面的相互作用比较，BSA封闭后TOCNF表面的相互作用具有相似的趋势(图2b)。

图 2. SPR 传感图：a)捕获抗体吸附到 TOCNF 上。b) 抗 THC + THC 免疫复合物与 15 μg/mL 抗 THC 和 1 μg/mL THC 吸附在 BSA 处理后的 TOCNF（红色）和 BSA 阻断的 TOCNF（蓝色）上物理吸附的捕获抗体表面上。c)将捕获抗体偶联到TOCNF上，经EDC/NHS活化，随后捕获抗体和乙醇胺处理。d) BSA 处理后，TOCNF 上偶联的捕获抗体表面上吸附有 15 μg/mL antiTHC 和 2 或 10 μg/mL THC 的抗 THC + THC 免疫复合物，抗 THC (15 μg/mL) 结合到不含 THC (0 μg/mL) 的偶联捕获抗体 生物界面作为参考。

此后，比较化学偶联抗体的结合效率发现，图2C显示出抗体在EDC/NHS激活后的TOCNF表面有较显著吸附。乙醇胺(pH 8.5)处理后SPR角减小，推测pH的变化影响了蛋白质的净电荷，静电相互作用的变化使抗体与界面结合松散。图2D显示了两种浓度的免疫复合物以及仅有捕获抗体存在时与生物界面的结合情况，与预期相同，在仅有检测抗体存在时固定捕获抗体的TOCNF表面上的结合率很低(表2)，而THC存在时能够检测到免疫复合体的结合。值得注意的是，尽管THC疏水性较强，但在高度亲水的NC膜锚定表面与捕获抗体发生了相互作用，可能由于水分子的排出导致化学反应的熵增加，宏观上增加了捕获抗体-THC的结合亲和力。捕获抗体+THC免疫复合体结合不能随的捕获抗体量的增加而增加(图2和表2)，高浓度(10μg/mLTHc)使捕获抗体+THc免疫复合物结合率增加约11%，低浓度(2μg/mLTHc)使结合率降低约25%。

表 2 捕获抗体固定方法对 TOCNF 表面免疫复合物结合的影响。

2.2. 形貌变化

利用AFM成像技术展示了固载抗体、吸附牛血清白蛋白和免疫复合物对表面修饰碳纳米薄膜形貌的影响（图3）。

图 3. SPR 传感器上样品的 AFM 图像和分布：a) 原始 TOCNF，b) TOCNF 吸附的捕获抗体生物界面，c) 暴露于 BSA 和 THC + 抗 THC的TOCNF 生物界面，d) TOCNF 偶联捕获抗体生物界面，以及 e) 暴露于 BSA 和免疫复合物后 TOCNF 上的偶联捕获抗体生物界面。、

2.3. THC在纸基的比色检测

同样以TOCNF为锚定层，采用EDC/NHS法将捕获抗体固定在测试区(T)上，二抗(抗小鼠免疫球蛋白)附着在对照区域(C)上。用HRP标记捕获抗体，在过氧化氢存在下与ABTS反应生成蓝绿色产物(图2),此外，3wt%的牛血清白蛋白和5wt%的酪蛋白水解物溶液作为封闭剂应用于底物上，采用THC阳性样和THC阴性样进行检测。图4显示了不同样品在测试区和控制区的示意图及相应的颜色，四氢大麻酚阴性样品检测后，仅在控制区出现绿色圆点(图4b)，在对THC阳性样品进行测试后，在测试区和控制区都有着色，10-15 min得到比色结果（图4c）。为了突出锚定层和有效固定抗体的重要性，我们在物理吸附抗体的TOCNF上进行了类似的测试，其他系统底物没有着色。

图4.试纸上的THC检测：a)在试纸和对照区域上显示固定的传感元件的示意图，b)在没有THC(阴性样本)存在的试纸上的对照区域上的抗THC-HRP结合示意图和Abts的比色图像，c)在试纸上与THC阳性样本进行检测时免疫复合物结合和对照区域上的抗THC-HRP结合的示意图，以及在试纸上用THC阳性样本进行检测时在对照区域上的抗THC-HRP结合的示意图。

3. 结论